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中科普瑞昇B-27無血清添加劑 使用方法

 更新時間:2024-08-30 點擊量:159

B-27 無血清添加劑(50X)50X 濃度,使用前請用基礎(chǔ)培養(yǎng)基(如Neurobasal™)稀釋到 1X。如準(zhǔn)備50 mL培養(yǎng)基:將1mL的B-27無血清添加劑(50X)加入到49mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)中。

中科普瑞昇B-27無血清添加劑 使用方法

一、培養(yǎng)基的配置

由于 L-谷氨酰胺在水溶液中不穩(wěn)定,其分解產(chǎn)物對細(xì)胞具有毒性,神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基和B-27中都未包含 L-谷氨酰胺,因此在配制培養(yǎng)基時須另外添加L-谷氨酰胺。

(1)置于4 ℃解凍本產(chǎn)品。

(2)在使用前無菌添加 2%本產(chǎn)品和0.5 M L-谷氨酰胺至神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基,配制神經(jīng)元培養(yǎng)基(注:下文中出現(xiàn)的“神經(jīng)元培養(yǎng)基"即指此種添加B-27添加劑和L-谷氨酰胺的神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基)。

(3)注意:剩余的本產(chǎn)品可以等分成工作體積,并儲存在-20 ℃。在以后的試驗中根據(jù)需要解凍相應(yīng)體積的本產(chǎn)品。避免反復(fù)凍融本產(chǎn)品。

(4)對于原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng),神經(jīng)元培養(yǎng)基(由前述步驟制備)需要額外補充25μM的L-谷氨酸,在培養(yǎng)的第4天以后的換液中應(yīng)不再添加谷氨酸。配置好的培養(yǎng)基,可于 2-8 ℃的避光保存一周。

二、細(xì)胞培養(yǎng)步驟

下列步驟已在大鼠胎兒原代皮層神經(jīng)元中測試。

(1)用無菌的冷的 0.05 mg/L 多聚賴氨酸水溶液包被培養(yǎng)表面(玻璃或細(xì)胞培養(yǎng)級塑料),每平方厘米表面使用 0.15mL,37℃放置過夜 (16 h);

(2)去除多聚賴氨酸溶液,并用無菌蒸餾水沖洗兩次(須清洗,因為多聚賴氨酸對細(xì)胞有毒性)。在超凈工作臺中打開培養(yǎng)板的蓋子通風(fēng),直到每個孔都干燥。培養(yǎng)板干燥后可以立即使用或在4℃ 最多保存 2 周。

(3)根據(jù)實驗室標(biāo)準(zhǔn)操作流程從胚胎 16-18 days 的大鼠中分離獲得原代海馬/皮層神經(jīng)元細(xì)胞,或參考細(xì)胞株提供的說明書解凍凍存的原代大鼠神經(jīng)元細(xì)胞。

(4)將神經(jīng)元培養(yǎng)基在 37的水浴鍋中預(yù)熱,建議細(xì)胞接種密度為 2x105 個/孔(24 孔板為例)或根據(jù)自身實驗對密度進行調(diào)整。

(5)在將接種了細(xì)胞的培養(yǎng)皿放置于 37oC,5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(6)在接種 16-24 h 后,更換一半體積的新鮮的培養(yǎng)基,之后 2-3 days 換液。

三、分離原代大鼠胚胎神經(jīng)元

下列程序推薦用于培養(yǎng)受精 18 天的大鼠胚胎海馬神經(jīng)元和大腦皮層神經(jīng)元。

(1)從受精 18 天的大鼠胚胎中分離大腦皮層和雙側(cè)海馬。

(2)在預(yù)置了培養(yǎng)基的錐形管中收集所有的組織。放置,直到所有的組織都已解體。

(3)使組織沉積在管的底部,然后小心地去除上清液,只留下剛好可覆蓋組織的最少量的培養(yǎng)基。

(4)在不含鈣離子的培養(yǎng)基中,使用 2 mg/L 過濾滅菌的木瓜蛋白酶溶液,在 37 °C 下酶解組織約 30 min,期間輕搖錐形管以幫助降解,5 min/次。每對海馬組織使用 2 mL 酶溶液。

(5)加入兩倍體積的培養(yǎng)基以恢復(fù)二價陽離子的濃度,停止酶解。

(6)使未解離的組織沉降至管底(約 2 min),然后把上清液轉(zhuǎn)移到 15 mL 離心管中,離心,150×g,5 min。

(7)在 1 mL 神經(jīng)元培養(yǎng)基中重懸沉淀物,取 10 μL 進行細(xì)胞計數(shù)。后續(xù)的操作按照“復(fù)蘇和培養(yǎng)凍存的神經(jīng)元"的第 8-10 步驟進行。

四、復(fù)蘇和培養(yǎng)凍存的神經(jīng)元

重要提示:原代神經(jīng)元細(xì)胞將會貼附在裸露的塑料或玻璃表面,建議事先用神經(jīng)元培養(yǎng)基沖洗所有的塑料和玻璃器皿的內(nèi)表面,以獲得最高的回收率和產(chǎn)量。

由于細(xì)胞從凍存狀態(tài)復(fù)蘇時極其脆弱,請在整個操作過程中不要震蕩或離心細(xì)胞。我們建議每次只解凍一管細(xì)胞。務(wù)必減少從液氮中轉(zhuǎn)移凍存管到 37oC水浴中的操作時間。

(1)在解凍細(xì)胞之前,用神經(jīng)元培養(yǎng)基沖洗無菌的 15 mL 錐形管,然后在超凈工作臺中通風(fēng)晾干。

(2)從液氮中取出凍存管時可稍微擰松管帽以釋放壓力,然后再擰緊。

(3)在 37 °C 水浴中輕柔攪拌凍存管以快速解凍細(xì)胞(小于 2 min)。當(dāng)觀察到凍存管中只有很少量的冰晶存在時(觸摸凍存管仍然感覺是冷的)從水浴中取出。

(4)在工作臺臺面上輕敲凍存管以使管內(nèi)液體沉降到管底。使用事先用神經(jīng)元培養(yǎng)基沖洗并干燥過的 1 mL 吸頭極其輕柔地將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到事先沖洗并干燥的 15 mL 錐形管中。

(5)用 1 mL 預(yù)熱的神經(jīng)元培養(yǎng)基沖洗沖洗凍存管,以每秒一滴的速度極其緩慢地加入到 15 mL 錐形管中的細(xì)胞里。每加一滴都輕柔地轉(zhuǎn)動錐形管一次。不要一次即把全部培養(yǎng)基加到錐形管中。

(6)慢慢地逐滴加入另外 2 mL 預(yù)熱的培養(yǎng)基,使管內(nèi)的液體體積為 4 mL。用 1 mL 吸頭輕柔地混合液體,注意不要造成任何氣泡。

(7)用一個事先沖洗干燥過的吸頭吸取 10 μL 細(xì)胞懸液加入到含有 10 μL ,0.4 %臺盼藍(lán)的微量離心管中,輕敲管壁以混勻溶液。使用手動的細(xì)胞計數(shù)方法測定活細(xì)胞密度。解凍的細(xì)胞的活率應(yīng)超過 50 %。

(8)在已經(jīng)事先用多聚賴氨酸包被(參見“細(xì)胞培養(yǎng)步驟")的 24 孔板中每孔中接種大約 2x105 個細(xì)胞或按所需的細(xì)胞密度接種。加入預(yù)熱的神經(jīng)元培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液稀釋到每孔 500 μL。按照“細(xì)胞培養(yǎng)步驟"中的 5-6 步驟進行神經(jīng)元的培養(yǎng)。在 37oC,含 5 %CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

五、產(chǎn)品目錄表


貨號

產(chǎn)品名稱

規(guī)格

PRS-B27S

B-27無血清添加劑

10ml





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